动态比浊法测定磷酸川芎嗪氯化钠注射液中细菌内毒素含量
磷酸川芎嗪具有抗血小板凝集、扩张小动脉、改善微循环和脑血流的作用，临床上被广泛用于闭塞性血管疾病、脑血栓形成、脉管炎、冠心病、心绞痛等⋯。由于中药注射剂的生产过程存在众多未知因素影响，为加强其质量控制，保证用药安全有效，故需对其终产品的内毒素限度加以监控。细菌内毒素检查法是药品热原检查中家兔法的替代方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便的特点，而细菌内毒素定量检查法这一新技术则能更有效地排除供试品对鲎试剂的干扰，准确测定细菌内毒素的含量_2J。笔者采用动态比浊法测定磷酸川芎嗪氯化钠注射液中细菌内毒素的含量，以期建立起此注射液的细菌内毒素定量检查方法。1 试药与仪器
1．1 试药磷酸川芎嗪氯化钠注射液(华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部提供，批号分别为0109151，O1101ll，0lll171，O1l1251，规格：磷酸川芎嗪0．1 g，每瓶100 mL)。4批样品热原检查均合格。动态比浊法鲎试剂(湛江安度斯生物有限公司生产，批号：001123，灵敏度为0．06 EU·mL ，每支1．2 mL)；细菌内毒素工作标准品(中国药品生物制品检定所生产，批号：2000—3，每支50 EU)；细菌内毒素检查用水(BET水，湛江安度斯生物有限公司生产，批号：00l222，每支5 mL)。
1．2 仪器 EDS-98型细菌内毒素定量检测仪(北京金山川科技发展有限公司)。
2 方法与结果
2．1 细菌内毒素限值( )的确定 按公式L：K／_3』。K(静脉注射给药最小致热阈值)：5．0 EU·kg- ·， (磷酸川芎嗪人用最大剂量)=3．3 mg·kg · ；故L：5．0／3．3：1．5 EU·mg一。
2．2 标准曲线的制作及可靠性以BET水逐级稀释细菌内毒素工作标准品，使其内毒素终浓度分别为0．500 00，0．250 00，0．125 00，0．062 50，0．031 25 EU·mL- ；各取0．1 mL加入预先加有鲎试剂0．1 mL的反应管内，混合均匀，插入EDS-98型细菌内毒素检测仪中测定临界时间(t)，每一浓度平行做3管，并以BET水作阴性对照。当阴性对照结果不超过 ，(标准曲线最低浓度)时，以内毒素浓度(C)的对数值为横坐标，以相应的临界时间均值(t)的对数值为纵坐标，线性回归得标准曲线为：lgt：2．623 76—0．278 18 lgC，r：一0．987 4，反应时间在424～1 378 s，相关系数绝对值大于0．980，故标准曲线成立_3J。
2．3 供试品干扰试验
2．3．1 最大有效稀释倍数( 彻)的计算 按公式彻： ／ ．_3』，L为磷酸川芎嗪氯化钠注射液内毒素限值(1．5 EU·rag- )，C为注射液浓度(1．0 mg·mL- )，入。为标准曲线的最低浓度(0．031 25 EU·mL )，计算得： 48。
2．3．2 供试品干扰试验将磷酸川芎嗪氯化钠注射液(批号0109151)以BET水依次做2，4，8，16，32倍稀释；以供试品原液(1．0 mg·mL )及各级稀释液作为供试液；选择标准曲线中间浓度(0．125 EU·mL )作供试品阳性对照(PPC)。分别取上述各液0．1 mL加入预先加有鲎试剂0．1 mL的反应管内，混合均匀，迅速插入内毒素检测仪中测定临界时间；供试品及PPC均平行做3管，以BET水作阴性对照，以临界时间均值参照标准曲线方程计算内毒素实测值，并计算平均回收率，平均回收率(％)=(阳性对照液内毒素实测值一供试液内毒素实测值)／强化内毒素浓度X 100％。动态比浊法干扰试验是以供试品中添加内毒素的平均回收率来判断，若回收率在50％ ～200％ 范围内，表明供试品溶液对鲎试验无干扰_2 J。由表1可见，供试品原液及其2倍稀释液对鲎试剂产生干扰作用；而磷酸川芎嗪4～32倍稀释液的平均回收率均在规定范围内，表明从其4倍稀释起对鲎试剂反应无干扰。经比较，笔者选用无干扰且回收率最好的16倍稀释(0．062 5 mg·mL )进行正式测定。
2．3．3 供试品干扰试验的验证 为确证16倍稀释的有效性，另选3个批号磷酸川芎嗪注射液(批号：0110111，0111171，0111251)进行验证试验。将各批样品做16倍稀释为供试品，选择标准曲线中间浓度(0．125 EU·mL )作为供试品阳性对照(PPC)，其他具体操作参照干扰试验。供试品及PPC均平行做3管，以BET水作阴性对照，以临界时间均值参照标准曲线方程计算内毒素实测值，并计算平均回收率。由此可见，验证试验的结果与干扰试验基本一致：3个批号磷酸．ItI芎嗪氯化钠注射液在16倍稀释下，其平均回收率均在有效范围(50％ ～200％)之内，表明此稀释度对鲎试验无干扰。
2．4 供试品细菌内毒素定量测定根据以上干扰试验结果，取4批磷酸川芎嗪氯化钠注射液以16倍稀释，并制备供试品阳性对照，每一系列平行做2管，进行定量测定，以临界时间均值参照标准曲线方程计算磷酸川芎嗪氯化钠注射液中细菌内毒素的含量。由表3可见，以动态比浊法测定磷酸川芎嗪氯化钠注射液中细菌内毒素的含量，选择16倍稀释可以进行无干扰测定；且4批供试品结果均小于磷酸川芎嗪氯化钠注射液的细菌内毒素限值(1．5 EU·mL )，与热原检查结果相符。
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动态比浊法是根据测定达到预设反应液的浊度变化(透过光量比)值所需要反应时间的对数(1gt)与细菌内毒素浓度的对数(1gC)成反比例关系，从而进行内毒素定量检测的一种体外分析方法 J。其检测灵敏度高，检测范围宽，结果准确，克服了凝胶法主观判断等
因素的影响，因而被许多国家药典所收载。将其应用于天然药物注射液的细菌内毒素定量测定是一种新的尝试，实践证明该法较凝胶法具有更大的优越性。基于细菌内毒素与鲎试剂的反应是由于一系列酶促放大作用而产生的，故其干扰因素众多，主要包括供试品的酸碱度、金属离子浓度、非特异性鲎试剂激活物、对仪器检测光源(405 nln)的吸收干扰等 ]。磷酸川芎嗪氯化钠注射液pH值(3．5～5．0)显然超出了鲎试剂反应所要求的pH值6～8的范围，这说明pH值是磷酸川芎嗪对鲎试验产生干扰的主要因素。按照《中华人民共和国药典>2ooo年版附录指导原则，一般采用稀释法消除这种干扰。通过干扰试验、验证试验和供试品细菌内毒素定量测定的结果表明，磷酸川芎嗪氯化钠注射液采取16倍稀释进行细菌内毒素定量检测是可行的。
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